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    剑南春天益老号窖泥特殊功能菌的选育及应用

      中国白酒界有这样一个亘古不变的道理:“千年老窖万年糟,酒好需得窖池老”。泥窖是浓香型白酒的发酵容器,也是浓香型白酒区别于其他酒类重要的物质性标签之一。剑南春传承“泥窖纯粮固态发酵”技艺,特别依托于其独有的老窖窖池。老窖池中富含酿酒特殊功能微生物菌群和微量元素,每一轮投入酿酒的粮食,都是窖池的一次新生,随着岁月的增长,这些物质不断向窖池深处繁殖渗透,滋养着窖池。剑南春“天益老号”千年活窖群,经过1500年的自然淘汰、驯化、优选形成一个特定的微生物菌系,赋予了剑南春芳香优雅、绵柔甘洌的典型滋味特色。对于浓香型白酒企业而言,酿酒发酵窖池窖泥功能微生物的相对丰度直接决定产品优级品率的高低。因此利用现代生物技术解析窖泥微生态系统多样性特征,在优质老窖泥中选育窖泥功能微生物应用于酿酒生产,对新窖老熟及窖池养护具有重大的现实意义。


    材料与方法


      1.1材料


      窖泥样品:剑南春股份有限公司各酿酒车间,窖龄为2年、5年、10年、20年以及50年以上。


      1.2窖泥微生物群落结构


      1.2.1窖泥总RNA提取


      窖泥样品按10cm2/mL加Trizol后,于室温放置5min,使其充分裂解。12000r/min离心5min,弃沉淀。按200μL氯仿/mLTrizol加入氯仿,振荡混匀15min,室温放置15min。4℃、12000r/min离心15min。吸取上层水相,至另一离心管中,按0.5mL异丙醇/mLTrizol加入异丙醇混匀,室温放置5~10min,4℃、12000r/min离心10min,弃上清,RNA沉于管底。按1mL75%vol乙醇/mLTrizol加入75%vol乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀。4℃、8000r/min离心5min,尽(原载于中国白酒杂志第201906期)量弃上清液。室温晾干或真空干燥5~10min。可用50μLH2O溶解RNA样品。RNA经提取后,经富集mRNA、去除rRNA及反转录生成cDNA等过程,获取供高通量测序用的实验样品。利用Illumina的HiSeq2000测序仪进行测序。测序工作委托商业测序公司完成。


      1.2.2基因组、转录组数据的处理及生物信息学分析


      基因组数据处理包括DNA片段统计和拼接、生物信息解释、基因表达分析(RNA-Seq)等。宏基因组与转录组数据放在一起进行拼接,以获得尽可能长的DNA重叠组。具体分析过程如下:①利用Newbler软件(454LifeScience)和SOAPdenovo软件(http://soap.genomics.org.cn)进行基因组的组装;②与NCBI的nr/nt库进行序列比对,根据已知序列定位Contigs之间的连接顺序;③结合MG-RAST等软件进行生物信息学数据分析。


      1.3窖泥功能微生物选育


      1.3.1窖泥功能微生物分离


      培养基配方:乙酸钠0.5%,酵母膏0.5%,K2HPO40.04%,(NH4)2SO40.05%,MgSO40.02%,调pH6.0~6.5,121℃高压灭菌20min,冷却至65℃,在无菌条件下加入2%无水乙醇。


      无菌条件下取10g窖泥于装有90mL无菌水并放有玻璃珠的250mL三角瓶中,室温振荡30min,于80℃水浴中处理10min,取菌液按10倍的梯度逐级稀释到10-6,取各稀释度菌液1mL于无菌平皿中,倒入灭菌后冷却至50℃的培养基,混匀,待凝固后放入35℃厌氧培养箱培养5~7d。挑单菌落于液体培养中于35℃培养至产气为止。取发酵液1mL于小试管中,加入0.5mL乙醚和2%硫酸铜溶液1mL,充分摇匀,静置分层后,在乙醚层呈现蓝色,即证明有己酸生成。颜色越深,含量越高,共筛选到15株产己酸能力较高的单菌株,分别命名为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13、F14、F15。


      1.3.2发酵条件优化


      选取温度、发酵天数、乙酸钠和乙醇浓度进行4因素3水平设计正交实验,结果见后表1。


      1.3.3功能微生物定性


      (1)菌株16SrDNA序列分析


      DNA提取和PCR扩增,把扩增后的片段送往上海生工进行测序分析。


      (2)全自动微生物鉴定仪鉴定


      采用Biolog微生物鉴定仪鉴定,方法如下:


      第一步、在Biolog推荐的培养基上培养微生物:将获得的纯培养菌种接种至Biolog推荐的培养基BUA+B上,35℃厌氧培养。在BUA+B上培养两代。培养时间为24~48h。第二步、准备接种物:使用未接种的含有接种液的干净接种管调整浊度仪透光度100%。用棉签从琼脂平板中有细胞生长的地方沾取菌落,调整细胞浓度到65%T。第三步、接种微孔板:按每孔100μL的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中。盖好微孔板的盖子。第四步、孵育微孔板:放入厌氧工作站中培养20~24h。培养温度35℃。读板,诠释结果。


      1.4窖泥功能微生物的应用


      将功能菌株逐级扩大培养应用于人工培养窖泥中,菌株增殖培养工艺流程:纯菌株→厌氧管液体培养(一级种子液)→厌氧瓶液体培养(二级种子液)→发酵罐液体厌氧培养(三级种子液)→成熟功能菌发酵液→应用于生产。


      将功能菌发酵液一部分应用于公司扩建工程新窖人工培养窖泥的培养工艺中,在窖泥培养过程中分阶段加入一定量功能菌液,添加功能菌液培养成熟的人工窖泥与同批次未添加功能菌液的人工窖泥做对比分析,同时对糊窖后窖池发酵产酒酒体中己酸乙酯含量进行对比分析。


      将功能菌发酵液一部分添加到糟醅中进行强化发酵,以同批次不添加发酵液的处理作对照,最后对发酵产酒酒体中己酸乙酯含量进行对比分析。


    结果与讨论


      2.1窖泥微生物群落结构


      2.1.1门水平下窖泥中的微生物组成


      基于功能基因,利用MG-RAST中的M5NR数据库对其进行注释,在门水平对不同窖龄窖泥中微生物的种类进行分析,其结果如图1所示。对比结果表明,2年、5年窖龄窖泥中优势功能微生物主要分布在厚壁菌门(Firmicutes)、广古菌门(Euryarchaeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinbacteria)中,相对丰度总和均超过85%;而10年、20年、50年以上窖龄及天益老号窖泥中优势功能微生物只分布在厚壁菌门(Firmicutes)、广古菌门(Euryarchaeota)、拟杆菌门(Bacteroidetes)中,相对丰度总和超过80%。


      图1窖泥样品微生物组成(门水平)


      其中,厚壁菌门(Firmicutes)中的梭菌属(Clostridium)可对大分子有机物进行代谢并生成小分子挥发性有机酸。在已有研究中,其被认为是己酸合成的主要微生物之一。而己酸及己酸乙酯则是酒中风味物质的主要贡献者。在所有窖泥样品中,厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度在40.6%~45.03%范围内。最大值在2年窖龄窖泥中获得;最小值在天益老号窖泥中获得;随着窖龄的增加厚壁菌门相对丰度呈下降趋势,10年后趋于稳定。不同窖龄窖池中该类微生物的相对丰度差异并不显著。


      广古菌门(Euryarchaeota)包含了古菌中的大多数种类,其中包括产甲烷菌。在窖池这一厌氧环境中,甲烷菌的广泛分布已有较多报道。从广古菌门(Euryarchaeota)的相对丰度值分析,其变化范围介于22.5%~26.32%之间。其中,天益老号窖泥中,该类微生物的相对丰度最低;而在2年窖龄窖泥中,广古菌门(Euryarchaeota)则获得了最高的相对丰度值;随着窖龄的增加,广古菌门相对丰度呈下降趋势,10年后趋于稳定。不同窖龄窖泥中该类微生物的相对丰度并无显著差异。


      拟杆菌门(Bacteroidetes)包含了拟杆菌纲、黄杆菌纲及鞘脂杆菌纲三大类细菌。窖池中的拟杆菌属和噬胞菌属,可以降解纤维素,为其他微生物提供能源。拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度值变化范围介于6.50%~15.85%之间。其中,2年窖龄窖泥中,该类微生物的相对丰度最低;而在20年及以上窖龄窖泥中,拟杆菌门(Bacteroidetes)则获得了最高的相对丰度值;随着窖龄的增加拟杆菌门相对丰度呈上升趋势,10年后趋于稳定。


      变形菌门(Proteobacteria)是一类外膜主要由脂多糖组成的革兰氏阴性菌,大多数具有固氮能力,兼性或专性厌氧。变形菌门在窖龄短的窖泥中所占的相对丰度值较高,2年窖龄中其相对丰度值达3.40%,5年窖龄其相对丰度值为3.01%。


      放线菌门(Actinbacteria)是原核生物中的一个类群,是一类革兰氏阳性细菌。因其菌落呈放射状而得名。大多有基内菌丝和气生菌丝,少数无气生菌丝,多数产生分生孢子,有些形成孢囊和孢囊孢子。大多数为好氧,可以产生抗生素。放线菌门(Actinbacteria)在窖龄短的窖泥中所占的相对丰度值较高,在2~5年窖龄窖泥中其相对丰度值为3%~4%,而在10年以上窖龄窖泥中其相对丰度值下降到1.2%左右。基于功能基因的群落分析表明,不同窖龄窖池内的优势微生物,在门水平上,其相对丰度并无显著差别。


      2.1.2属水平下窖泥中的微生物组成(图2)


      图2窖泥样品微生物组成(属水平)


      基于功能基因,利用MG-RAST中的M5NR数据库对其在属水平进行注释,不同窖龄窖泥中微生物的种类分析结果如图2。根据各属的相对丰度值,选择数值最高的前10类微生物进行展示,分别为:梭菌属(Clostridium)、甲烷囊菌属(Methanoculleus)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、紫单胞菌属(Parabacteroides)、互营单胞菌属(Syntrophomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、真杆菌属(Eubacterium)和一种产氢细菌(Ethanoligenens)。


      梭菌属(Clostridium)是一类能形成芽孢、厌氧生长的革兰氏阳性菌,它们可对大分子有机物进行代谢并生成小分子挥发性有机酸。在已有研究中,其被认为是己酸合成的主要微生物之一。在所检测窖泥样品中,梭菌属的相对丰度在5.32%~13.26%范围内变化。其中,最小值在2年窖龄窖泥中获得;最大值则在50年及以上窖龄窖泥中获得。随着窖龄的增加,梭菌属相对丰度值呈增长趋势,10年后趋于稳定。10年以上窖泥梭菌属相对丰度值为2年的2.31倍,为5年的1.46倍。


      甲烷囊菌属(Methanoculleus)是产甲烷微生物,以二氧化碳为底物,通过氢营养途径进行甲烷的合成;但是该类产甲烷菌不能以乙酸为底物,通过乙酸营养途径进行甲烷合成。在所有样品中,甲烷囊菌属(Methanoculleus)的相对丰度值介于9.75%~13.55%之间。最小值在天益老号窖泥中获得,最大值在5年窖龄窖泥中获得。随着窖龄的增加,甲烷囊菌属相对丰度值呈下降趋势。


      拟杆菌属(Bacteroides)是一类革兰氏染色阴性菌,无芽孢,专性厌氧。该类微生物可代谢大分子有机物,产生乙酸、丁酸等有机酸。在所分析窖泥样品中,该类微生物的相对丰度值介于5.56%~6.17%之间。不同窖龄窖泥间的拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度差异极小。


      乳酸杆菌属(Lactobacillus)是一群杆状的革兰氏阳性菌,它们能把碳水化合物(主要指葡萄糖)发酵成乳酸。酿酒微生物可以利用乳酸为底物进行其他物质的生物合成,如丙酸菌可以利用乳酸产生丙酸,丁酸菌利用乳酸为碳源生成丁酸,己酸菌利用乳酸为碳源生成己酸,乳酸通过酯化反应生成乳酸乙酯,丁酸可进一步生成丁酸乙酯,己(原载于中国白酒杂志第201906期)酸可进一步生成己酸乙酯等。乳酸菌在酿酒中还发挥代谢活性作用,能直接为其他微生物提供生长繁殖可利用的必需氨基酸和各种维生素,还能提高矿物元素的生物学活性,为固态法白酒发酵微生物提供必需的营养物质,促进酿酒微生物的生长繁殖。在所分析窖泥样品中,乳酸杆菌属的相对丰度值介于5.41%~8.11%之间。其中,最小值由2年窖龄窖泥获得;最大值由天益老号窖泥获得;随着窖龄的增加,乳酸杆菌属的相对丰度值呈增加趋势。


      甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)也是一种产甲烷古菌,其既可利用二氧化碳为底物,通过氢营养途径进行甲烷的合成;也可以乙酸为底物,通过乙酸营养途径进行甲烷合成。在各年窖龄窖泥中,甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)的相对丰度分别为2年0.28%、5年0.48%、10年5.18%、20年5.25%、50年5.30%、天益老号5.35%;随窖龄的增加呈增长趋势。经方差分析发现,不同窖龄窖泥间,甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)的相对丰度值具有显著差异(p<0.05)。基于以往研究,甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)在20年以上窖龄窖泥中是2年窖龄窖泥的18.75倍以上;是5年窖龄窖泥的11.14倍,其相对丰度有显著提升。


      甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)为典型小聚集体八叠状。有时聚集体为大的胞囊,具有一个共同的外壁而包裹单独的球状细胞。该类微生物不产生芽孢。单个的球形细胞可能对去污剂裂解或高渗敏感,无鞭毛,不可运动,是一种极端严格厌氧微生物。其最适NaCl浓度为0.1~0.5mol/L,中温菌的最适温度为30~40℃,嗜热菌的最适温度为50~55℃。该类产甲烷菌可利用乙酸或二氧化碳作为底物进行甲烷合成代谢,但从不利用甲酸。可在缺氧的海水沉积物、湖水沉积物或厌氧消化器等体系内发现分离。


      在窖泥的微生物代谢网络中,微生物将大分子有机物(纤维素等多糖、蛋白质、脂类)分解为小分子有机酸(如乙酸等)的过程中,氢气作为代谢产物会同时生成。老窖泥中含有大量甲烷八叠球菌属(Methanosarcina),这些菌群能利用氢气、二氧化碳或乙酸产生甲烷,这些物质都是酿酒发酵过程中的副产物,尤其是氢气,如果不去除,就会抑制有益发酵菌群的生长。甲烷菌实际上起到了调控发酵过程的作用,它们将氢气利用掉,产己酸菌才能正常生长,而在窖龄较小的窖泥中,由于pH值较低,会抑制产甲烷菌的生长。因此,该菌的存在可有效降低乙酸和氢气的累积,消除抑制效应,使后续的碳链延长(丁酸、己酸的合成)过程得以顺利实现。


      紫单胞菌属(Parabacteroides)、互营单胞菌属(Syntrophomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、真杆菌属(Eubacterium)、一种产氢细菌(Ethanoligenens)在不同窖龄窖泥中的相对丰度值略小,都呈现新窖池(2~5年)窖泥中相对丰度值高于老熟窖池(10年及以上)窖泥。紫单胞菌属(Parabacteroides)能代谢生成丁酸、乙酸等有机酸类;互营单胞菌属(Syntrophomonas)可通过与耗氢微生物的共培养而降解热力学上难利用的酿酒纤维素等原料;芽孢杆菌属(Bacillus)能代谢生成丁酸、乳酸类物质;真杆菌属(Eubacterium)能利用葡萄糖或蛋白胨产生丁酸、乙酸或甲酸;产氢细菌(Ethanoligenens)主要发酵产物为H2,起调节微生物群落代谢平衡作用。


      从属水平多样性分析发现,甲烷囊菌属、互营单胞菌属在新窖池窖泥中明显高于老窖池窖泥;而梭菌属、甲烷八叠球菌属在老窖池窖泥中远远高于新窖池窖泥。研究结果表明,梭菌属和甲烷八叠球菌属微生物是窖泥老熟度的标志性微生物。


      2.2窖泥功能微生物选育


      2.2.1菌株产己酸发酵条件优化


      选取温度、发酵时间、乙酸钠和乙醇浓度进行4因素3水平设计正交实验。



      结果表明,乙醇浓度对菌株产己酸影响较大,其次为乙酸钠浓度。温度和发酵时间影响相对较小。产己酸的最适条件为:温度35℃,培养时间15d为宜,乙醇浓度2%,乙酸钠浓度1%。


      菌株发酵产己酸优化培养基:乙酸钠1.5%,黄水2%,酵母膏1.0%,葡萄糖0.5%,K2HPO40.05%,(NH4)2SO40.05%,MgSO40.02%,pH6.0~6.5,灭菌后加入2%无水乙醇。采用优化后发酵培养条件对15株代谢己酸的单菌株进行产己酸试验。产己酸对比分析结果见图3。


      图3菌株产己酸量对比分析图


      从图3可知,F6产己酸能力最强。经发酵工艺的进一步优化,产己酸能力可达到18000mg/L,为此对F6菌株进行了16SrDNA基因的序列分析和全自动微生物鉴定仪分析。


      2.2.2菌株16SrDNA序列分析


      扩增后的片段测序(上海生工测序),通过美国国家生物技术信息中心的BLAST搜索程序,把试验中得到的序列信息与基因库中的基因序列进行比较而获得同源性分析结果。


      该菌株与生孢梭菌、嗜胺梭菌、匙形梭菌和无害梭菌的同源性均达到了99%,需进行进一步判定。


      2.2.3全自动微生物鉴定仪鉴定


      采用Biolog微生物鉴定仪鉴定该菌株结果见表3。经Biolog微生物鉴定仪鉴定,筛选得到高产己酸的菌株为生孢梭菌。因此,结合分子和Biolog微生物鉴定仪鉴定结果,确定菌株为生孢梭菌(Clostridiumsporogense)。


      该菌株为革兰氏阳性杆菌、产芽孢,次端生。在湿润培养基上,菌落平坦、边缘扩散,呈灰色,表面无光泽,半透明。生孢梭菌采用FEIQUANTA250扫描电镜扫描到的形态结构如图4。


      2.3窖泥功能微生物的应用



      2.3.1功能菌株的培养


      将选育的窖泥特殊功能菌株扩大培养应用于人工窖泥的培养和促进新窖老熟。培养成熟后菌液具有纯正窖香味,色泽金黄,有悬丝。我们将扩大培养的窖泥功能菌液应用于人工窖泥的培养和促进新窖老熟。具体按照图5所示进行培养。


      2.3.2应用于人工窖泥的培养(图6)


      采用微生物强化技术添加功能菌液的人工窖泥培养技术,所培养的人工窖泥窖香纯正,手感柔和,细腻,黏性好,使成熟窖泥中芽孢杆菌数提高了50%以上,产己酸能力提高了1倍(表4)。


      采用宏基因组技术检测人工窖泥培养技术优化前后生产的成熟人工窖泥微生物多样性特征,分析结果显示:添加窖泥功能菌的成熟人工窖泥微生物种类基本一致,但生产的窖泥老熟度标志性微生物梭菌属提高了1.73倍,甲烷八叠球菌属提高了2.04倍,从窖泥微生物菌落结构和老熟度标志性微生物丰度分析已接近5年窖龄水平。


      表4成熟人工培养窖泥性能对比分析表

      2.3.3应用于窖龄较短的窖池淋窖,促进新窖泥老熟


      将培养成熟的窖泥菌液用酒尾稀释(1∶50)后喷淋到刚出窖完毕的窖池窖壁(窖龄约5年),装入粮醅进行发酵,同时做同期对比实验。


      酿酒发酵研究结果表明,窖泥功能菌液的应用,对出酒率无显著影响,酒体中(酒样为65%vol~70%vol的基酒)己酸乙酯含量提高了35%左右,己酸乙酯含量与乳酸乙酯含量比接近2∶1(表5),达到浓香型白酒两大酯最佳比例,酒体感官评价:香气浓郁,味甜厚,尾味净,未喷淋功能菌的窖池酒体感官评价香气闷,味甜,尾味较净。所生产的基酒质量产品优级品率提高1倍以上。


    小结


      3.1基于宏基因组学-功能基因研究剑南春不同窖龄的窖泥微生物多样性特征发现,窖泥微生物主要由细菌和古菌两大类构成,在门水平上,新窖池窖泥中优势功能微生物主要分布在厚壁菌门、广古菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门中,相对丰度总和均超过85%;而老窖池窖泥中优势功能微生物只分布在厚壁菌门、广古菌门、拟杆菌门中,相对丰度总和超过80%。


      3.2从属水平多样性分析发现,甲烷囊菌属、互营单胞菌属在新窖池窖泥中明显高于老窖池窖泥;而梭菌属、甲烷八叠球菌属在老窖池窖泥中含量远远高于新窖池窖泥。研究结果表明,梭菌属和甲烷八叠球菌属微生物是窖泥老熟度的标志性微生物。


      3.3在剑南春老窖泥中分离到1株高产己酸的功能微生物,产己酸能力可达18000mg/L,定性为生孢梭菌。


      3.4窖泥功能微生物应用于人工窖泥的培养,人工窖泥产己酸能力提高近一倍,酒体中己酸乙酯含量提高了60%,有效缩短了新窖老熟周期。应用于新窖老熟,同样使得酒体中的己酸乙酯提高了67%,确保浓香型白酒浓郁幽雅的典型风味特征,产品优级品率提高了1倍以上【壹酒购】